Fetal Bovine Serum 胎牛血清在細胞培養過程中，經常加入5%-20%的胎牛血清，常用的Gibco胎牛血清濃度是10%。我們在實驗中使用10%的Gibco南美 胎牛血清培養293T細胞，效果非常好。但是有些細胞也會使用5%的Gibco FBS或者20%的Gibco胎牛血清，要根據具體 細胞選擇合適的Gibco胎牛血清濃度。

Gibco胎牛血清如何選擇

Fetal Bovine Serum

Gibco特級胎牛血清使用方法

在細胞培養(yang) 過程中，經常加入5%-20%的胎牛血清，最常使用的Gibco胎牛血 清濃度是10%。高濃度的血清可能改變細胞的基因表達譜，影響後續實驗的結果，我們(men) 在實驗中使用10%的Gibco南美 胎牛血清培養(yang) 293T細胞，效果非常好。但是有些細胞也會(hui) 使用5%的Gibco FBS或者20%的Gibco胎牛血清，要根據具體(ti) 細胞選擇合適的Gibco胎牛血清濃度。

Gibco胎牛血清保存方法

1、需要長期保存的血清必須儲(chu) 存於(yu) -20℃ - 70℃ 低溫冰箱中。4℃冰箱中保存時間切勿超過1個(ge) 月。切勿將血清在 37℃放置太久,否則血清會(hui) 變得渾濁,同時血清中的有效成分會(hui) 被破壞，而影響血清質量。如果一次無法用完一瓶,可 將40～45ml分裝於(yu) 無菌50ml離心管中。由於(yu) 血清結冰時體(ti) 積會(hui) 增加約10%,因此,血清在凍入低溫冰箱前，必須預留一 定體(ti) 積空間,否則易發生汙染或玻璃瓶凍裂。
2、一般廠商提供的血清為(wei) 無菌,無需再過濾除菌。如發現血清有懸浮物,則可將血清加入培養(yang) 液內(nei) 一起過濾,切勿直接 過濾血清。
3、瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法:-20℃ 至 -70℃ 低溫冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1天.然後移入室溫,待全 部溶解後再分裝,一般以50ml無菌離心管可分裝40～45ml。在溶解過程中須規則搖晃均勻(小心勿造成氣泡),使溫度 與(yu) 成分均一,減少沈澱的發生。.切勿直接將血清從(cong) -20℃進入37℃解凍,這樣因溫度改變太大,容易造成蛋白質凝集而 出現沉澱。
4、熱滅活是指56℃, 30分鍾加熱已解凍的血清.加熱過程中須規則搖晃均勻.此熱處理的目的是使血清中的補體(ti) 成分滅活.除非必須,一般不建議作此熱處理,因為(wei) 熱處理會(hui) 造成血清沉澱物顯著增多,而且還會(hui) 影響血清的質量.補體(ti) 參與(yu) 反應有:細胞毒作用, 平滑肌細胞收縮, 肥大細胞和血小板釋放組胺, 增強吞噬作用, 促進淋巴細胞和巨噬細胞 發生化學趨化和活化。
5、血清中的沉澱物 絮狀物:主要是血清中的脂蛋白變性及解凍後血清中纖維蛋白造成,這些絮狀物不會(hui) 影響血清本身 的質量.可用離心3000rpm,5分鍾去除,也可不用處理。 顯微鏡下"小黑點":經過熱處理過的血清,沉澱物 的形成會(hui) 顯著增多。有些沉澱物在顯微鏡下觀察象"小黑點",常誤認為(wei) 血清受汙染。一般情況下,此小黑 點不會(hui) 影響細胞生長,但如果懷疑血清質量,則應立即停止使用,更換另一批號的血清。

Gibco胎牛血清使用中遇到的常見問題總結

一、血清滅活問題。

1、問：加到培養(yang) 基中的血清必須滅活嗎？

答：不是必須的，看做什麽(me) 實驗了。

2、問：Gibco胎牛血清滅活是56℃ 30分鍾嗎？

答：如果用於(yu) 培養(yang) 大多數的腫瘤細胞，血清一般是不需要滅活的，這樣可以有效保存血清中的生長因子。 但是如果用於(yu) 培養(yang) 一些表麵具有補體(ti) 受體(ti) 的細胞，如內(nei) 皮細胞，血清是需要滅活，一般是56℃，30min。

3、問：我要做滋養(yang) 細胞培養(yang) ，胎牛血清要滅活嗎？

答：進口的一般都已滅活，國產(chan) 的不一定，最好還是滅活一下再用較安全。

4、問：我用病毒上清轉染細胞，培養(yang) 用的血清需要滅活嗎？因為(wei) 血清中可能有些補體(ti) 和抗體(ti) ，是不是會(hui) 影 響轉染？我想未滅活的血清中含些抗體(ti) 補體(ti) 可能會(hui) 和病毒相結合，影響轉染，正確嗎？細胞是單核細胞白血病細胞， 病毒是病毒包裝細胞PT67收集的病毒上清。為(wei) 什麽(me) 要用無血清培養(yang) 基加病毒孵育幾小時，目的是什麽(me) ？

答：血清一定要滅活，可以先用無血清培養(yang) 基加病毒孵育幾小時以後再加血清。避免雜蛋白對病毒和宿主 結合過程的幹擾，一般是2-6小時，根據細胞的狀態決(jue) 定。血清不一定需要滅活，滅活的目的是將血清中的補體(ti) 滅活 ！這要根據實際情況而定，如果沒有把握那就滅活吧，也不麻煩56度半個(ge) 小時。

5、問：(1)我買(mai) 的是Gibco北美胎牛血清，要滅活嗎？有些說法是需要，有些說直接解凍後就可以加入到培 養(yang) 基中；我配製胰蛋白酶液，用的是D-PBS，有關(guan) 係嗎？

答：關(guan) 於(yu) 血清的熱滅活，是很多人感興(xing) 趣也存在一定爭(zheng) 議的話題。大多數實驗室將血清的熱滅活還是作為(wei) 常規來執行，因為(wei) 有兩(liang) 個(ge) 作用，第一是滅活補體(ti) ，第二是滅活血清中可能存在的支原體(ti) 。但是實驗者並沒有考慮熱處 理對血清中的生長因子、氨基酸等成分帶來的負麵影響。

我在實驗室處理血清的時候，有一次水浴箱在滅活過程中出現故障，溫度升高到80℃，血清變成了凝膠狀 ，我重新處理了另外一份血清，將兩(liang) 份血清對比，發現高溫直接影響到血清所含的抗體(ti) 蛋白。在56℃下滅活半小時以 上，肯定也會(hui) 對裏麵的蛋白起到破壞作用。下次有機會(hui) 我做個(ge) 延長滅活時間的實驗試試，看看到底有多大的影響。熱 滅活之後，血清放在四度冰箱久了，就會(hui) 有沉澱產(chan) 生，這常常會(hui) 被認為(wei) 是微生物汙染或者是黑膠蟲汙染。為(wei) 了驗證到 底有沒有汙染，常常又會(hui) 把血清放置37℃溫育，但是血清中的蛋白會(hui) 進一步析出，最後還是要做鏡檢，無菌培養(yang) 試驗 ，和革蘭(lan) 氏染色試驗，非常麻煩。

我看過一份資料，裏麵提到70%的實驗者認為(wei) 滅活是理所當然的。常規滅活建議的溫度在45℃到62℃之間， 而時間則從(cong) 15分鍾到60分鍾不等。其中常用的手法是56℃熱處理30分鍾。隨著血清采集、處理、加工工藝的提高 ，許多早先認為(wei) 是熱滅活的原因已經不再成立，隻有少數對血清進行熱滅活的研究者在實驗中證實了這一步驟的有效 性和必要性。有人比較過11個(ge) 不同細胞株，發現其中熱滅活對6 個(ge) 細胞株(HBAE，MDBK，Vero，成纖維細胞，MRC-5) 的生長帶來負麵影響，三個(ge) 細胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受熱滅活的影響，而隻有兩(liang) 個(ge) 細胞株(Balb/3T3， Sp2/0Ag14 hybrid)，在熱滅活之後，細胞生長有輕微的改善。所以，在正常的操作下，熱滅活通常對細胞的生長沒 有明顯的促進作用。

你可以摸索一下，血清從(cong) -20℃冰箱拿出來之後在常溫解凍，然後混勻分裝成兩(liang) 份，一份滅活，一份不滅活 ，比較這兩(liang) 種血清對細胞是否有影響。然後再確定是滅活還是不滅活。這個(ge) 過程最多也就一個(ge) 星期。同時你還要考慮 血清滅活與(yu) 否對你後續的實驗有沒有影響。

問：(2)分裝後的血清從(cong) -20℃取出放4℃讓其液化，卻見血清比較混濁，有沉澱產(chan) 生，這屬正常嗎？

答：正常。

二、血清的保存問題。

1、問：2016年6月到期的GIBCO胎牛血清到2017年5月還能用嗎？

答：隻有試試了，如果一直在-20℃凍著來者，應該還可以，先少用點看看。養(yang) 細胞係應該沒問題，原代不行。

2、問：請問我自然溶化好的胎牛血清和1640培養(yang) 基今天用不上，明天用，我不想放到冰箱裏，放在室溫下 一晚行嗎？100毫升培養(yang) 瓶加多少培養(yang) 基呢？

答：可以放4℃。4-5ml。

3、問：4℃冰箱內(nei) 保存3個(ge) 月的胎牛血清，能否繼續使用？相關(guan) 細胞和其它試劑的代價(jia) 比較高，不敢輕易嚐試。

答：需要長期保存的Gibco胎牛血清必須要保存在-20至-70℃的低溫冰箱中，4℃冰箱中保存時間不要超過1個(ge) 月。

三、血清滅活時溫度問題。

1、問：因為(wei) 實驗室水浴鍋失控，血清滅活時，溫度到了61.7℃，這血清還能用嗎？

答：多長時間啊？短時間應該可以吧，我有一次加熱了一個(ge) 多小時，還照樣用。

2、問：我滅活胎牛血清時，用的電磁爐，定在了70℃，本來說調溫度到56℃再放血清的，後來忘了，就把 血清放進去了，所以滅活的溫度肯定超過56℃了，不知道這樣對血清有沒有影響？

答：常規滅活建議的溫度在45℃到62℃之間，而時間則從(cong) 15分鍾到60分鍾不等，其中常用的手法是56℃ 熱處理30分鍾。看看你養(yang) 的細胞是什麽(me) ，一般的話估計問題不大，要是很珍貴的細胞還是慎重一點啊。熱滅活目的是 為(wei) 了去除血清中補體(ti) 等對熱敏感的物質， 在對補體(ti) 滅活以外，熱處理同時也對血清中可能存在的支原體(ti) 具有滅活作 用。現在好像不主張熱滅活，熱滅活經常給血清產(chan) 品帶來負麵影響，對血清的加熱經常導致血清中沉澱的產(chan) 生，此外 ，有研究結果證實熱滅活步驟減弱了胎牛血清和小牛血清對細胞的促粘附作用。

四、FBS可否代替人AB型血清？

問：我現在在做人的外周血b淋巴細胞的培養(yang) ，文獻上要求用人的AB型血清，但是我覺得很多代理商都沒有 。我想FBS代替，但不知道可否，我先是擔心免疫排斥之類，但是我查了些資料後，應該不會(hui) (我覺得)。但是我又不 能夠TRY。因為(wei) 細胞因子確實太貴了，所以谘詢一下。謝謝！

答：你最好照文獻的做。除非你係列實驗證明你用代用品的結果與(yu) 文獻的相同(你還是要用到文獻的試劑) 。細胞培養(yang) 的影響因素很多，特別是培養(yang) 基的成分。

五、血清的製備方法問題。

1、問：我的實驗需要自己製備一些血清用於(yu) 培養(yang) 細胞，有沒有人知道用於(yu) 培養(yang) 細胞的血清需要怎樣的製備 過程？

答：自己製備血清當心汙染啊。如果無菌條件好的話，用靜置析出方法就行。

2、問：一般我們(men) 用得胎牛血清用前還要滅活，我想用大鼠的血，不知道要不要滅活？

答：你直接把采來的血液在離心管裏4℃過夜，離心，取上清，在無菌過濾，也可滅活，然後分裝凍存，用 時再配。

3、問：如果滅活會(hui) 不會(hui) 對血清中的一些因子有損傷(shang) ？

答：加熱可以滅活補體(ti) 係統。激活的補體(ti) 參與(yu) 溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺， 激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究、培養(yang) ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。滅活 一般不會(hui) 對血清中的一些因子損傷(shang) 的。

六、心肌細胞原代培養(yang) 時血清的使用問題。

1、問：在進行心肌細胞原代培養(yang) 時，需要用含血清的培養(yang) 基中止胰酶的消化作用，我現在使用的是含血清 10%的培養(yang) 液，但近日看北醫一個(ge) 細胞培養(yang) 的課件發現，有用1%血清培養(yang) 液進行中止消化的，想問一下，1%的是否可 以，效果是否有保證？這樣確實能節省不少血清的。

答：關(guan) 於(yu) 心肌細胞元代培養(yang) 的FBS問題：

(1)1%的血清完全培養(yang) 基可不可以，得看你胰酶的用量。但是在心肌細胞元代培養(yang) 就不行。 10%的FBS完全 培養(yang) 基效果都不太好，開始心肌細胞元代培養(yang) 需要高濃度的FBS，20%左右，但這就有出現另一個(ge) 問題，在FBS完全培 養(yang) 基中，成纖維細胞呈優(you) 勢細胞，須得在培養(yang) 基加入適量的BrdU以抑製其生長，純化心肌細胞。

(2)FBS的作用不僅(jin) 僅(jin) 是拿來中和胰酶，隻是FBS中的一些蛋白質如α-巨球蛋白等有抑製胰酶活性作用 。

(3)元代心肌細胞培養(yang) 的FBS使用，有講究：剛開始使用20%左右的高濃度的FBS，後逐漸遞減為(wei) 無血清的 DMEM/F-12培養(yang) 基培養(yang) 。

2、問：我胰酶的用量是0.08% ，並混和了0.08%的膠原酶。FBS要高濃度遞減是否是說的在細胞培養(yang) 中啊， 難道在消化時終止也需要如此高的濃度嗎，還有，我的BRDU隻用到48小時就不用了，因為(wei) 擔心其損傷(shang) 太大，可以持續 用多久呢？

答：我用10�S終止的，然後差速1h，然後還是用10�S的HG-dmem養(yang) 的，沒有用brdu，心肌細胞還是比 較多和穩定的，我第3天就可以用，第2天晚上看就會(hui) 有搏動。

七、血清和培養(yang) 基的種類及品牌問題。

1、問：細胞培養(yang) 的胎牛血清用哪個(ge) 公司的產(chan) 品比較好呢？周圍有人用PAA或Hyclone的，這兩(liang) 種跟Gibco或 sigma出品的差別大嗎？

答：如果是長得非常快得細胞如pa317，293，c6等惡性腫瘤細胞，一般得國產(chan) 血清就可以，如果是原代培 養(yang) 的細胞，最好應用胎牛血清或類標準胎牛血清，Hyclone公司血清的質量不如GIBCO(同類血清)。國產(chan) 的杭州四季 青和甘肅民海（中美和資）不錯。有些細胞(如：sf9，293還有其他一些元代細胞)，用Gibco的比其他兩(liang) 種好很多， 會(hui) 大大加速試驗進度。對於(yu) 其他一些細胞(如：vero，MDCK，pk)四季青，Hyclone的小牛血清足矣！另外，Gibco的 還要看產(chan) 地。

2、問：最近要訂一瓶胎牛血清，實驗室之前都在用小牛血清，沒有買(mai) 過胎牛血清。請問哪個(ge) 公司的好一些 ？問過試劑公司，有兩(liang) 種：一種是PAA的(分普通級和優(you) 級)，一種是Hyclone的(隻有普通級，而且是新西蘭(lan) 產(chan) 的)。 試劑公司推薦使用PAA優(you) 級的，但看好多文獻都用Hyclone的，公司說是因為(wei) 現在Hyclone的都不是美國進口的了。請 問用的哪種胎牛血清比較好？

答：民海的效果還不錯，要是不放心國產(chan) 的，那就買(mai) 進口的。進口的好多公司都有，新西蘭(lan) 產(chan) 的效果一般 。Hyclone和Gibco的都還可以。民海的似乎比四季青的要好些。複蒙的感覺也不錯。

3、問：四季青“無噬菌體(ti) 、低內(nei) 毒素胎牛血清”與(yu) “無支原體(ti) 胎牛血清”的區別 ？培養(yang) 腫瘤傳(chuan) 代細胞用哪一個(ge) 比較好些？

答：用無支原體(ti) 胎牛血清就可以啦。

4、問：SKBR-3細胞培養(yang) 用哪種型號的1640培養(yang) 基及胎牛血清？

答：我一直用GIBCO的1640，你可以買(mai) 含HEPES的1*10L的包裝，胎牛血清也是用的GIBCO，10%就行。請查 閱： www.atcc。。ｏｒｇ

八、牛血清汙染噬菌體(ti) 的問題。

1、問：有誰知道小牛血清製造過程中怎樣能夠避免噬菌體(ti) 的汙染，以及對已汙染噬菌體(ti) 的牛血清怎樣能夠 除去噬菌體(ti) ？

2、問：我也想知道，我用的血清中大部分都有噬菌體(ti) ，它對細胞培養(yang) 到底有什麽(me) 影響？

暫無回答。

九、培養(yang) 基血清濃度問題。

問：在1640裏加血清時加多了，90ml裏加了20ml血清，約為(wei) 18%，以前都是加10ml的，查了網上多建議用 10%-15%，有關(guan) 係嗎？

答：我認為(wei) 一般來說血清濃度的較大波動對細胞的狀態影響較大，建議再加90ml1640調成10%。血清濃度大 當然細胞狀態感覺要好，但是高濃度的血清可能改變細胞的基因表達譜，影響後續實驗的結果。10%的濃度培養(yang) 鼻煙 癌細胞很好。

十、問：MTT加藥的時候加不加血清？加藥時要用無血清的培養(yang) 基嗎？

答：我的藥就是用含血清的培養(yang) 基稀釋的，不含血清的培養(yang) 基對細胞有毒性或抑製作用，無形中對細胞造 了一個(ge) serum-free的模型，細胞在提內(nei) 本來就是有血清供應，如果該藥物都不能對抗，那該藥物就沒有什麽(me) 臨(lin) 床價(jia) 值了，這是我的理解。

十一、PC12細胞培養(yang) 所用血清問題。

問：我正準備購買(mai) 上海細胞所的未分化的PC12細胞，需要滅活的馬血清，可現在買(mai) 血清很困難，好像是海關(guan) 有block，代理商這麽(me) 說的，我原定購買(mai) 的Gibco的horse surum，現在無法買(mai) 到了，好容易找到一個(ge) 目前可以進血清的公司Hyclone，有一種Donor Equine serum是馬血清嗎？

答：Hyclone的Donor Equine serum可以用，我以前用的就是這個(ge) 。。

十二、AB血清的製備問題。

問：本人想從(cong) 人的外周血中分離AB血清的，用於(yu) B淋巴細胞的培養(yang) 。謝謝大家給點建議。人的血，來之不易啊。

答：是AB血型人的血清嗎？這種血清即沒有抗A型抗原抗體(ti) ，也沒有抗B型抗原抗體(ti) 。分離血清時將采集的 血液注入試管中，待血液凝固後離心分離血清。可將采集的血液放在37℃水浴箱中促進血液凝固，減少凝固時間。離 心可在2500～3000rpm，10min，足可以分離血清。分離後將血清吸出保存即可。分離血清的量可按采集血液的50%左 右計算，因為(wei) 紅細胞占總血液的50%左右。當然整個(ge) 過程要注意無菌操作。

十三、Gibico的胎牛血清內(nei) 是否含糖？

問：我想做糖誘導細胞凋亡的試驗。細胞培養(yang) 液裏加入了20%的胎牛血清。因此胎牛血清裏是否含有糖對我 實驗的培養(yang) 液糖終濃度影響比較大。今天打電話問GIBCO公司的技術顧問，回答我糖濃度少於(yu) 5μg/ml，因此基本 可認為(wei) 是不含糖。但我今天把胎牛血清送到我們(men) 醫院檢液科，結果卻是：6.2mmmol/l(葡萄糖氧化酶法)。難道是檢 測人血清的血糖濃度的方法不能用於(yu) 檢查牛血清嗎？(另起茶水驗尿事件？)檢驗科沒有給我回答。

答：應該是不含糖的。請參照gibco的網站： https://www.invitrogen。。ｃｏｍ/content/sfs/brochures/B_08A00_0619_FBS_bro.pdf。第五頁我做了個(ge) 記號。直接 點擊鏈接就可以看到它的說明書(shu) 頁麵。我想我們(men) 肯定要以公司的說明書(shu) 為(wei) 準。至於(yu) 為(wei) 什麽(me) 檢驗科測起來有誤差，我想 可能是樣本不一樣，需要用標誌品矯正有關(guan) 。具體(ti) 需要檢驗科的戰友解釋了。

十四、血清或培養(yang) 基產(chan) 生了顏色或沉澱的問題：

1、問：我用的是四季青的胎牛血清，56℃30分鍾滅活後出現了白色少量絮狀沉澱，是不是汙染？還能不能 再用？血清的生產(chan) 日期是2006年7月(現在是2007年6月11日)。

答：應該問題不大。你可以取少量血清放入培養(yang) 皿中，37℃過夜培養(yang) 看看就知道是否汙染了。血清中沉澱 物的出現有許多種原因，但普遍的原因是由於(yu) 血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在 血渭解凍後，也會(hui) 存在於(yu) 血清中，亦是造成沉澱物的主要原因之一。但這些絮狀沉澱物，並不影響血清本身的質量。 若您欲去除這些絮狀沉澱物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nei) ，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培養(yang) 基內(nei) 一起 過濾。

2、問：我用MTT法測細胞的增殖，用DMSO裂解細胞，發現把DMSO加入到孔中就會(hui) 形成乳白色(用的含胎牛血 清的1640培養(yang) 基，由於(yu) 沒有離板子的離心機，所以沒有去除培養(yang) 基直接加的DMSO)。以前用含小牛血清的培養(yang) 基沒有 看到有這種情況。該怎麽(me) 解決(jue) ？

答：為(wei) 什麽(me) 要用離心機離心呢？難倒你養(yang) 的是懸浮細胞嗎？如果是貼壁細胞的話直接將MTT倒掉，再加DMSO 即可，我們(men) 就是這麽(me) 做的，效果很好！並且測細胞的增殖的話如果不去掉MTT就加DMSO的話誤差應該很大！有時不一 定就是血清的原因，可能跟你的MTT放置的時間或以及其他成分有關(guan) ！

3、問：(1)GIBCO胎牛血清500ml，今天解凍後沒有混勻直接分裝，結果使得前麵的幾管是清亮的，後麵就 帶有棕色的，不知有沒有影響？估計有什麽(me) 影響？前麵的成分好還是棕色的成分好啊？

答：肯定有。最好還是重新混合重新分裝，我覺得有效成分會(hui) 集中在棕顏色部分。

問：(2)為(wei) 什麽(me) 會(hui) 出現棕色呢？

答：血清中的棕色多一些可能是因為(wei) 紅蛋白的含量高些的緣故吧。

問：(3)血清滅活之後可以存放嗎？我的是前天滅活的，但是沒有加到培養(yang) 基裏，而是放在冰箱裏，那下次 可以直接用嗎？還是再次滅活啊？

答：當然可以，如果多的話，分裝後最好放在－20℃，下次用時再解凍，也不用再滅活。最好用一管拿一 管，少許血清可以放在4℃。分裝時還要注意不要裝得太滿，以免溢出汙染。

十五、汙染和過濾的問題。

1、問：懷疑血清染菌，想用濾膜過濾一下，可否自己用0.22μm濾膜過濾？對血清性質有多大影響？有 做過的麽(me) ？

答：可以過濾的，血清當出廠時都是0.22μm或0.1μm過濾除菌。想證明有沒有染菌不用過濾這麽(me) 麻煩 ，隻要放置於(yu) 37℃過夜就可以了，如果有微生物汙染會(hui) 變渾濁的，如果還是澄清的就說明沒有問題的。實驗室中血清 很難直接過濾，一般要加到培養(yang) 基中再過濾。我們(men) 實驗室製備培養(yang) 基時，都使用濾膜過濾，一般而言如果製備1-2瓶 培養(yang) 基，一個(ge) 濾膜及一支30ml注射器可以過濾50ml小牛血清。如果大量製備培養(yang) 基也可以將血清加到培養(yang) 基中，使 用0.22微米的大濾膜一起過濾。

2、問：我懷疑我用的完全1640培養(yang) 液被汙染了，準備重新過濾消毒，過濾後是否需要補充胎牛血清？如需 又如何補充？

答：完全1640培養(yang) 液被汙染了，如果是支原體(ti) 的話，過濾沒有作用，支原體(ti) 可以通過濾膜。我們(men) 用1640液 ，都是配液後保留500ml，然後其他的分裝100-200ml，現用現配因為(wei) 血清比1640要貴，如果你想過濾的話，建議你 加原比例血清，因為(wei) 血清不會(hui) 很容易通過濾膜。最主要的還是找到可能汙染的原因。

3、問：加好了血清雙抗的培養(yang) 基由於(yu) 汙染了再過濾後還能用嗎？

答：建議不要用了。在加了雙抗的情況下已經汙染，那麽(me) 細菌汙染的可能性會(hui) 較小了。一般的過濾除不能 去除病毒或者部分真菌的汙染的。

4、問：我準備把使用的完全1640培養(yang) 液重新過濾一遍，不知道培養(yang) 液中的血清成分是否能通過濾膜，過濾 後是否還需要補充胎牛血清？如需又如何補充？

答：可以透過，但是隨著液體(ti) 量的增多會(hui) 很慢，如果不加壓會(hui) 比較麻煩，還有最好用低蛋白吸附的，不然 損失是比較大的。

十六、問：懸浮細胞培養(yang) 時能否加血清？如果加了會(hui) 有什麽(me) 結果？為(wei) 什麽(me) 懸浮細胞培養(yang) 時就不能加血清？

答：血清是細胞培養(yang) 基中重要的培養(yang) 成份之一，對細胞生長有廣泛影響。在細胞培養(yang) 時，我們(men) 通常會(hui) 加入 10%的血清。血清的質量對細胞培養(yang) 的成功至關(guan) 重要。一般說來，牛血清包括以下成分：生長因子(如激素，白細胞介 素等)，他們(men) 可以促進細胞生長；貼附因子，他們(men) 可以促進細胞的貼壁，往往隻有細胞貼壁才能增值(懸浮培養(yang) 的細胞 除外)；蛋白質(如血清白蛋白，球蛋白等)，既可以作為(wei) 營養(yang) 物質，又可以中止胰酶的作用；還有很多成分不明的物 質。血清還可以起到解毒作用，如脂肪酸、重金屬和某些蛋白酶的毒性。血清還可以是細胞免受機械損傷(shang) 。因此，無 論是貼壁細胞還是懸浮細胞，血清是不可少的。除非因實驗要求無血清培養(yang) 時，例如：為(wei) 使細胞同步化時，我們(men) 會(hui) 采用無血清培養(yang) 的。單純的說懸浮細胞培養(yang) 不能加血清就沒有太多的道理了。

十七、關(guan) 於(yu) 中和消化液需要的血清量。

問：用胰蛋白酶消化細胞後，需要用血清中和。具體(ti) 這種中和作用所要求的胰蛋白酶和血清之間的比例是 多少？

答：做了很久的試驗，真的沒有想過胰酶和血清的對應關(guan) 係。不過細想下來，這個(ge) 應該也沒有固定的比值 。血清的品種都是不同的，成分必然有差異，如何能確定其與(yu) 胰酶的比值關(guan) 係？我們(men) 消化細胞的時候，如果是傳(chuan) 代， 細胞變形後，吸出胰酶直接加入適量的hanks液或者全培，這個(ge) 量看自己的喜好和吹打細胞方便而定。一般都可以中 止消化的。不會(hui) 存在繼續消化的事情。如果是從(cong) 組織上消化細胞做原代培養(yang) ，我一般都使用全培進行中止，而且加的 很多，0.25%的胰酶，用10%血清，按1:2的比例應該是足夠的。當然全培是2，一般我養(yang) 細胞的時候，會(hui) 用國產(chan) 的比 較便宜的血清配製全培，專(zhuan) 門用於(yu) 中止消化，這樣有幾個(ge) 好處：一是中止消化的效果應該好於(yu) hanks液吧，再是也有 利於(yu) 維持細胞活性。而且這部分液體(ti) 會(hui) 被離心去掉，血清便宜，離心掉了不會(hui) 心疼。而養(yang) 細胞的時候用好血清。個(ge) 人 觀點，僅(jin) 供參考。

十八、血清中的懸浮物問題。

1、問：發現培養(yang) 的細胞瓶中背景有許多的小黑點，培養(yang) 液中也有一些漂浮的物。看了之前的帖以為(wei) 是膠原 蟲。本打算換液，換液前特意看了下前些天配的培養(yang) 液，肉眼發現培養(yang) 液中有懸浮的顆粒狀物質(不多)，於(yu) 是放在鏡 下觀察，新鮮培養(yang) 液中有一些懸浮的小顆粒，不多。(培養(yang) 液是R1640+20%牛血清+1%雙抗)於(yu) 是又將分裝在4℃保存的 小牛血清拿出觀察，肉眼可見5、6個(ge) 白色小小球狀的物質，在血清瓶稍靠下的部位懸浮。鏡下觀察，也有少量的不知 什麽(me) 物質的東(dong) 西漂浮。小牛血清是Hyclone新西蘭(lan) 的，標簽上寫(xie) 已經經過2μm濾膜過濾處理。根據上述培養(yang) 液的情 況，是否說明培養(yang) 液已被汙染？如果是正常的血清是不是在鏡下不應該看到雜物，哪怕是極少量的？根據上述血清的 描述，是不是說明血清也存在問題，還能用嗎？補充：細胞培養(yang) 以來生長狀態就不好。買(mai) 血清的時候廠家說明不用滅 活，所以未滅活。

答：(1)血清應該-20℃保存，解凍血清時，請按照的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變 的溫度太大實驗顯示非常容易產(chan) 生沉澱物。

(2)血清中沉澱物的出現有許多種原因，但普遍的原因是由於(yu) 血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白 在血清解凍後，也會(hui) 存在於(yu) 血清中，亦可造成沉澱物。

(3)若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清，再放回冷凍，若存放於(yu) 4℃時，請勿超過一個(ge) 月，儲(chu) 存 在2－8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白，可能聚集而形成沉澱或可見的混濁。

(4)解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉澱的發生。

(5)排出了血清的原因，在考慮實驗用品和無菌操作的問題。

(6)細菌病毒、衣原體(ti) 、黑膠蟲汙染也很常見，如果細胞死的太多，影響較大建議更換培養(yang) 液。

2、問：今天在配培養(yang) 液時，發現血清裏麵有小碎片樣的漂浮物，血清仍然清亮，不渾濁。不知道是什麽(me) ， 問了實驗室的學長，說仍然可以用，但還是不放心，沒有用血清。求助園子的各位達人，這可能是血清出了什麽(me) 問題 ？我的血清用了一個(ge) 月不到，四季青的。

答：可能的原因：(1)培養(yang) 液配置時Votex不夠，當時是清亮的，但過一段時間會(hui) 析出來；(2)真菌汙染。

十九、更換無血清培養(yang) 基後細胞大量死亡的問題。

問：我使用Lipofectamine2000轉染成骨細胞，在轉染前要換上無血清的培養(yang) 基。本來條件模的好好的，轉 染效率也可以接受。但是寒假一回來就發生了怪事：細胞在有血清的培養(yang) 基中長的好好的，一換無血清的培養(yang) 基就死 亡。大概4個(ge) 小時就能看到較多的細胞飄起來。但是原來我換無血清培養(yang) 基，就算放那裏10個(ge) 小時都是沒問題的啊。 已經換了不同批次的培養(yang) 基，甚至吸管什麽(me) 的都換過了，但是就是不行，是怎麽(me) 回事？

答：(1)兩(liang) 周後的培養(yang) 液應補加穀氨酰胺，或者重新配液，轉染時應不含抗生素。

(2)確認操作方法和環境，建議檢查一下。

(3)Lipofectamine2000，脂質體(ti) 的毒性很大，如果有質粒參與(yu) 對細胞損傷(shang) 更大，如果Lipofectamine2000 在常溫放置過，對細胞更大，假期冰箱是否斷過電。

(4)培養(yang) 箱的溫度、c02濃度，濕度。

二十、完全培養(yang) 液的相關(guan) 定義(yi) 。

問：“完全培養(yang) 液一詞”，是指加了血清的培養(yang) 液嗎？我在做含藥血清的實驗，涉及到血清添 加量的問題。所以想弄明白文中所指的“完全培養(yang) 液”是否是含藥血清。

答：原液是指配置後過濾除菌。不完全培養(yang) 液是指不含有血清的原液，其他成分已補充。完全培養(yang) 液是指 不完全培養(yang) 液加入血清後稱完全培養(yang) 液。

二十一、血清相關(guan) 知識總結。

使用胎牛血清的注意事項：

血清是細胞培養(yang) 中最重要的元素之一。下麵是實驗室裏常會(hui) 遇到的問題，僅(jin) 供大家參考：

1、保存血清方法：

建議血清應保存在-5℃ 至 -2O ℃ 。然而，若存放於(yu) 4 ℃ 時，請勿超過一個(ge) 月。若您一次無法用完一瓶 ，建議您無菌分裝血清至恰當的滅菌容器內(nei) ，再放回冷凍。

2、如何解凍血清才不會(hui) 使產(chan) 品質量受損：

建議您將血清從(cong) 冷凍箱取出後，先置於(yu) 2～8℃ 冰箱使之溶解，然後在室溫下使之全溶。但必須注意的是， 溶解過程中必須規則地搖晃均勻。

3、血清解凍後發現有絮狀沉澱物出現，該如何處理：

血清中沉澱物的出現有許多種原因，但最普的原因是由於(yu) 血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成 凝血的蛋白之一)在血渭解凍後，也會(hui) 存在於(yu) 血清中，亦是造成沉澱物的主要原因之一。但這些絮狀沉澱物，並不影 響血清本身的質量。

若您欲去除這些絮狀沉澱物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nei) ，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培 養(yang) 基內(nei) 一起過濾。我們(men) 不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉澱物，因為(wei) 它可能會(hui) 阻塞您的過濾膜。

4、何謂熱滅活：

一般是以 56℃ ， 30 分鍾來處理已解凍的血清，因為(wei) 此加熱步驟，可以使補體(ti) 去活化，而補體(ti) 所參與(yu) 的 反應有 : 溶細胞活性，平滑肌的收縮，肥大細胞和血小板組胺的釋放，增強吞噬作用，淋巴細胞、巨噬細胞的趨化 和激活。

5、關(guan) 於(yu) 胎牛血清的滅活：

有必要做熱滅活嗎？

實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生 長隻有微小的促進，或沒有任何作用，甚至通常因為(wei) 高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。 而經過熱處理的血清，沉澱物的形成會(hui) 顯著的增多，這些沉澱物在倒立顯微鏡下觀察，像是“小黑點” ，常常會(hui) 讓研究者誤以為(wei) 是血清遭受汙染，而把血清放在 37℃ 環境中，又會(hui) 使此沉澱物更增多，使研究者誤認為(wei) 是 微生物的分裂擴增。

因此我們(men) 建議您，若非必須，您可以不需要做熱處理這一步。如此一來，不但節省您寶貴的時間，更確保 您血清的質量！

6、血清相關(guan) 知識：

如何避免沉澱物的產(chan) 生？

我們(men) 建議您在使用血清的時候，注意下列的操作 :

(1)解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-2O℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃ 至37℃)，實驗顯示非常容易產(chan) 生沉澱物。

(2)解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉澱的發生。

(3)請勿將血清置於(yu) 37℃太久。若在37℃放置太久，血清會(hui) 變得混濁，同時血清中許多較不穩定的成分也會(hui) 因此受到損害，而影響血清的質量。

(4)血清的熱滅活非常容易造成沉澱物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

(5)若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30 分鍾的原則，並且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖 晃不均勻，都會(hui) 造成沉澱物的增多。